Notre équipe a deux objectifs principaux.
Notre premier objectif est de comprendre comment les cellules eucaryotes contrôlent l’assemblage d’un cytosquelette organisé (principalement les microfilaments d’actine). Notre second objectif est de comprendre comment les différentes structures d’actine sont recyclées et renouvelées en fonction des besoins de la cellule.
Nos approches sont multidisciplinaires, utilisant des outils issus de la physique et de la chimie pour répondre à des questions biologiques fondamentales.

GRAND PUBLIC

Le bon fonctionnement d’une cellule au sein de son environnement est lié à sa capacité à exercer des forces ou à résister à des contraintes mécaniques. Un acteur principal de la cellule est son cytosquelette, qui est composé d’un ensemble de polymères biologiques organisés en réseaux. Par leur polymérisation, ou grâce à l’action de moteurs moléculaires, ces réseaux filamenteux assurent le bon fonctionnement de processus cellulaires tels que la migration, l’adhésion, la division ou encore l’endocytose.

Les propriétés de chacun de ces réseaux sont constamment remodelées grâce à l’action de protéines régulatrices, qui vont influencer l’assemblage, le désassemblage, ou l’organisation spatiale des polymères. Toute modification de l’activité de ces protéines régulatrices a donc un impact important sur l’organisation du cytosquelette, et par conséquent sur le comportement de la cellule. Par exemple, la transition d’une tumeur vers la malignité est associée à de nombreuses modifications génétiques et épigénétiques, ayant souvent pour conséquence des défauts d’assemblage du cytosquelette. Ceci altère les propriétés motiles et biomécaniques des cellules cancéreuses, leur permettant ainsi de se propager lors de la formation de métastases.

L’objectif de notre équipe est de dégager des principes généraux permettant de comprendre comment les cellules organisent leur cytosquelette, et comment celui-ci se réorganise sous l’effet de diverses perturbations. Cela implique une connaissance profonde des partenaires moléculaires impliqués, ainsi qu’une capacité à comprendre comment toutes ces molécules se coordonnent dans un environnement cellulaire complexe.

PUBLIC EXPERIMENTÉ

Nos travaux s’orientent principalement vers l’actine, qui polymérise en double-hélice pour former des filaments semi-rigides. L’organisation de ces filaments en structures organisées permet ainsi de créer des structures aux propriétés mécaniques variées.

Organisation du cytosquelette d’actine

Nos recherches relatives à l’organisation du cytosquelette d’actine s’articulent autour de deux questions principales.

La première question est de savoir comment les cellules contrôlent le niveau d’assemblage de multiples structures de filaments d’actine à partir d’une source d’actine monomérique commune et présente en quantité limitante. La cellule doit assurer une répartition optimale de ces ressources dans l’espace et dans le temps en fonction de ses besoins.

Nos recherches s’organisent autour de deux mécanismes différents. Tout d’abord, par l’activation de voies de signalisation particulières, la cellule contrôle l’activation ou l’inhibition de facteurs impliqués dans la génération de nouveaux filaments d’actine au sein de structures particulières. Ensuite, en modulant l’activité de facteurs supplémentaires impliqués de façon spécifiques dans l’assemblage de réseaux particuliers, la cellule possède un deuxième mécanisme puissant pour contrôler précisément les flux d’actine.

La deuxième question est de comprendre comment les cellules adressent précisément, spatialement et temporellement, de multiples familles de protéines régulatrices de l’actine à des réseaux particuliers. De façon surprenante, nous avons montré que le recrutement de ces protéines n’est pas dû à un réseau de signalisation spécifique, ou à un contexte cellulaire local tel que le pH ou une concentration saline. Au contraire, le mécanisme de ségrégation des protéines de liaison à l’actine est dû à une régulation biochimique finement contrôlée.

Nous explorons ainsi divers mécanismes permettant d’expliquer comment les filaments d’actine acquièrent une identité particulière. Le premier mécanisme vient du fait que la liaison des protéines régulatrices de l’actine est généralement directement sensible à l’organisation géométrique des filaments d’actine. Le deuxième mécanisme est lié au fait qu’une identité particulière peut être attribuée directement aux filaments d’actine, par exemple par l’apport de modifications particulières. Enfin, le dernier mécanisme est lié au fait que la liaison simultanées de multiples protéines régulatrices peut être favorisée ou limitée par des effet collaboratifs ou compétitifs.

Mécanismes contribuant à la ségrégation cellulaire des protéines de liaison à l’actine

Quelques publications récentes relatives à ce projet :

• ANTKOWIAK A, GUILLOTIN A, BOEIRO SANDERS M, COLOMBO J, VINCENTELLI R, MICHELOT A. Sizes of actin networks sharing a common environment are determined by the relative rates of assembly. PLoS Biol. 2019 Jun 10 ;17(6) :e3000317
• BOIERO SANDERS M, ANTKOWIAK A, MICHELOT A. Diversity from Similarity: Cellular Strategies for Assigning Particular Identities to Actin Filaments and Networks. Open Biol. 2020 Sep;10(9):200157
• BOIERO-SANDERS M, TORET CP, ANTKOWIAK A, GUILLOTIN A, ROBINSON RC, MICHELOT A.  Specialization of actin isoforms derived from the loss of key interactions with regulatory factors. Available in Bioarxiv: https://doi.org/10.1101/2021.02.09.430555

Dynamique de l’actine

La majorité des réseaux d’actine de la cellule sont renouvelés à des échelles de temps de l’ordre de la minute. En d’autres termes, l’actine alterne entre ses états monomériques et dynamiques, cette dynamique rapide étant maintenue grâce à l’énergie libérée par l’hydrolyse d’un ATP lié à chaque molécule d’actine. Le contrôle de cette dynamique fait appel à de multiples régulateurs de l’actine, dont les mécanismes moléculaires sous-jacents sont très mal compris. Cette méconnaissance entraîne notre incapacité à reconstituer à l’heure actuelle des réseaux d’actine dynamiques dans de petits volumes cellulaires à partir de protéines purifiées. Dépasser cette limitation sera essentiel pour envisager à l’avenir des reconstitutions de processus cellulaires dépendant de l’actine plus compliqués.

Notre compréhension de la dynamique de l’actine a peu progressé en l’absence de marqueurs performants permettant de mesurer le taux de recyclage des monomères d’actine. Ce recyclage étant corrélé à l’échange d’une molécule d’ADP pour un ATP, nous avons cherché des analogues nucléotidiques fluorescents pouvant lier l’actine, afin de mesurer précisément ces dynamiques d’échanges. Nous avons déterminé qu’une famille de molécules, les N⁶-(6-Amino)hexyl-ATP, ont des propriétés chimiques compatibles avec une liaison à l’actine. Nous avons montré que ces molécules possèdent des dynamiques d’échange comparable à celle de l’ATP, maintiennent des interactions fonctionnelles avec un certain nombre de protéines de liaison à l’actine importantes. Nous avons aussi déterminé que plusieurs couleurs de fluorophores peuvent être utilisées, que la polymérisation de l’actine est possible avec ces nucléotides fluorescents, et que ceux-ci sont hydrolysés par l’actine pour fournir de l’énergie à ces réactions.

(A) Modélisation structurale d’ATP-ATTO-488 lié à un monomère d’actine
(B) Filaments d’actine marqués par ATP-ATTO-488 et observés en microscopie à onde évanescente.

Quelques publications récentes relatives à ce projet :

• COLOMBO J*, ANTKOWIAK A*, KOGAN K, KOTILA T, ELLIOTT J, GUILLOTIN A, LAPPALAINEN P, MICHELOT A. A Functional Family of Fluorescent Nucleotide Analogues to Investigate Actin Dynamics and Energetics. Nat Commun. 2021 Jan 22;12(1):548 (* equal contribution)
• GRESSIN L, GUILLOTIN A, GUERIN C, BLANCHOIN L, MICHELOT A*. Architecture Dependence of Actin Filament Network Disassembly. Curr Biol. 2015 Jun 1;25(11):1437-47

Nos outils au laboratoire

Pour répondre à des questions mécanistiques précises, nous complémentons les approches de biochimie, de génétique et de biologie cellulaire classiques par des approches biomimétiques bio-inspirées. L’utilisation de systèmes simplifiés et la capacité de modifier les composants individuels sans la contribution active et la complexité de la cellule a déjà été démontrée comme étant essentielle à la compréhension de propriétés fondamentales de nombreux systèmes biologiques.

Nous utilisons généralement deux approches complémentaires pour reconstituer des processus biologiques d’intérêt. Avec des approches dites du “bas-vers-le-haut”, nous purifions les composants essentiels puis les assemblons. Les composants sont ajoutés un-par-un dans le système, afin de comprendre progressivement comment ils coopèrent, et afin de comprendre le rôle d’une molécule particulière en présence d’un nombre limité de partenaires. Cependant, pour des processus cellulaires impliquant la participation d’un nombre de molécules plus important, l’approche du “bas-vers-le-haut” peut s’avérer difficile car elle requiert la purification de tous les composants dans leur forme active. Dans ce cas-là, nous utilisons des extraits cellulaires, parce qu’ils contiennent un mélange de toutes les protéines qui sont essentielles au processus. Nous sommes experts dans la déplétion génétique de ces extraits, où les composants sont enlevés un-par-un. Cette approche du “haut-vers-le-bas” permet de tester l’effet de leur absence dans un environnement proche de l’environnement physiologique. Au final, les deux approches “du bas-vers-le-haut” et du “haut-vers-le-bas” sont utilisées dans différents systèmes expérimentaux afin de relier les systèmes biochimiques les plus simples à la complexité de la cellule.

Photo d’équipe pré-covid
De gauche à droite: Christopher Toret, Adrien Antkowiak, Agathe de Neufville, Jessica Colombo, Audrey Guillotin, Micaela Boiero-Sanders, Thomas Le Goff, Alphée Michelot and Reda Belbahri